Validación de los genes de referencia para RT-qPCR en tejido cardíaco de ratón inducido por obesidad y diabetes
DOI:
https://doi.org/10.33448/rsd-v9i11.9702Palabras clave:
Corazón; Rodend; Normalización; RefFinde; GAPDH.Resumen
La validación de genes de referencia es un paso fundamental para análisis de RT-qPCR. El presente trabajo tuvo como objetivo identificar y validar genes de referencia para RT-qPCR en tejido cardíaco de ratas de la especie Rattus norvegicus albinus, sometidas a obesidad asociada o no a diabetes mellitus tipo 2. Fueran introducidos los cambios metabólicos a los 42 días de vida y se realizó la eutanasia a los 70 días. Los ápices del corazón fueran destinados a la extracción de RNA. La técnica RT-qPCR se realizó en termociclador propio, la eficiencia de los cebadores encontrados por el software LinReg y la estabilidad de la expresión de los genes de referencia en las muestras se analizó mediante el algoritmo RefFinder. Los candidatos a genes de referencia fueron GAPDH, POLR2A, RPL32 y RPL4, y el gen diana utilizado para verificar las diferencias en la expresión génica de los candidatos a genes de referencia fue CMA1. Los animales obesos mostraron una disminución en la expresión del gen CMA1 en comparación con los dos genes de referencia más estables. Lo contrario ocurre cuando se compara con los dos genes de referencia menos estables. Los genes GAPDH y POLR2A son los mejores para normalizar las reacciones con las muestras en cuestión. No existe un gen de referencia universal, lo que requiere una validación sistemática para cada situación. El uso de genes de referencia no validados puede comprometer la interpretación de la expresión de los genes diana, lo que evitaría el reflejo de la situación real.
Citas
Ahmad, S., et al. (2014). Chymase – mediated angiotensin II formation in the heart of rats overexpressing the human angiotensin gene. Hypertension, 64(1), 1-12.
Andersen, C. L., Jensen, J. L., & Orntoft, T.F. (2004). Normalization of real-time quantitative reverse transcription-PCR data: a model-based variance estimation aproach to identify genes suited for normalization applied to bladder and colon cancer data sets. Cancer Research, 64(15), 5245–5250.
Brattelid, T., et al. (2010). Reference gene alternatives to GAPDH in rodent and human heart failure gene expression studies. BMC Molecular Biology, 11(22), 1-10.
Bortolin, R. H., et al. (2017). Anabolic effect of insulin therapy on the bone: osteoprotegerin and osteocalcin up-regulation in streptozootocin-induced diabetic rats. Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology, 120(3), 227-234.
Bustin, S. A., et al. (2013). The need for transparency and good practices in the qPCR literature. Nature, 10(1), 1063-1067.
Cefalu, W. T., et al. (2015) Advances in science, treatment, and prevention of the disease of obesity: reflections from a Diabetes Care editors’ expert forum. Diabetes Care, 38(8):1567-1582.
Chang, Z., et al. (2010). Microarray-driven validation of reference genes for quantitative real-time polymerase chain reaction in a rat vocal fold model of mucosal injury. Analytical Biochemistry, 406(2), 214-221.
Chen, X. (2017) Identification of reference genes and miRNAs for RT-qPCR in testosterone propionate-induced Bening prostatic hyperplasia in rats. Andrology, 50(4), 1-6.
Daneshpajooh, M., et al. (2017). HDAC7 is overexpressed in human diabetic islets and impairs insulin secretion in rat islets and clonal beta cells. Diabetologia, 60(1), 116-125.
Livramento, K. G. do et al. (2018). Gene expression profile analysis is directly affected by the selected reference gene: the case of leaf-cutting Atta sexdens. Insects, 9(8), 1-16.
Eissa, N., et al. (2017). Appropriateness of reference genes for normalizing messenger RNA in mouse 2.4-dinitrobenzene sulfonic acid (DNBS) - induced colitis using quantitative real time PCR. Nature Scientific Reports, 7(42), 1-13.
Farnsworth, C. W., et al. (2018). Exacerbated Staphylococcus aureus foot infection in obese/diabetic mice are associated with impaired germinal center reactions, Ig class switching, and humoral immunity. Journal of Immunology, 201(2), 1-14.
Fedoseeva, L. A., et al. (2014). MS2 phage ribonucleoproteins as exogenous internal control for RT-qPCR data normalization in gene expression, study of developing rat brain. Biochemistry, 79(7), 706-716.
Ferreira, E. C. S., et al. (2017). Zinc supplementation reduces RANKL/OPG ratio and prevents boné architecture alterations in ovariectomized and type 1 diabetic rats. Nutrition Research, 40(1), 48-56.
Hunt, H. B., et al. (2017). Bone tissue collagen maturity and mineral content increase with sustained hyperglicemia in the KK-Ay murine modelo f type 2 diabetes. Journal of Bone and Mineral Research, 33(5), 921-919.
Julian, G. S., et al. Analysis of the stability of housekeeping gene expression in the left cardiac ventricle of rats submitted to chronic intermittent hypoxia. Jornal Brasileiro de Pneumologia. 42(3), 1-4.
Khalilpourfarshbafi, M., et al. (2017). Mesenchymal stem cell-based therapies against podocyte damage in diabetic nephropathy. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, 14(3), 201-210.
Kirschneck, C., et al. (2016). Reference genes for valid gene expression studies on rat dental, periodontal, and alveolar bone tissue by means of RT-qPCR with a focus on orthodontic tooth movement and periodontitis. Annals of Anatomy, 204(1), 93-115.
Lambert, K., et al. (2018). Combination of nutritional polyphenols suplementation with exercise training counteracts insulin resistance and improves endurance in high-fat diet-induced obese rats. Nature Scientific Reports, 8(28), 1-10.
Lerco, M. M., et al. (2003). Caracterização de um modelo experimental de diabetes mellitus. induzido pela aloxana em ratos. Estudo clínico e laboratorial. Acta Cirúrgica Brasileira, 18(2), 132-142.
Li, X., et al. (2014) NMR-based metabonomic and quantitative real-time PCR in the profiling of metabolic changes in carbono tetrachloride-induced rat liver injury. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 89(1), 42-49.
Mao, Q., et al. (2016). Identification of suitable reference genes for BDV-infected primary rat hippocampal neurons. Molecular Medicine Reports, 14(6), 5587-5594
Mathur, D., et al. (2015). Bypassing hazard of housekeeping genes: their evaluation in rat granule neurons treated with cerebrospinal fluid of multiple sclerosis subjects. Frontiers in Cellular Neuroscience, 9(1), 375-406.
Marcioli, M. A. R., et al. (2018). Neurotrophin expression and histomorphometric evaluation in Wistar rats subjected to neural mobilization after compression of the median nerve. Revista Brasileira Ortopedia, 53(3), 276-280.
Nagao, K., et al. (2017). Pterostilbene, a dimethylated analog of resveratrol, promotes energy metabolism in obese rats. The Journal of Nutritional Biochemistry, 43(1), 151-155.
Panveloski-Costa, A. C., et al. (2011). Resistive training reduces inflammation in skeletal muscle and improves the peripheral insulin sensitivity in obese rats by hyperlipidic diet. Arquivos Brasileiros de Endocrinologia e Metabologia, 55(2), 155-163.
Petersson, S. J. (2014). Effect of testosterone on markers of mitochondrial oxidative phosphorylation and lipid metabolism in muscle of aging men with subnormal bioavailable testosterone. European Journal of Endocrinology, 171(1), 77-88.
Pereira, A. S., et al (2018). Metodologia da pesquisa científica. Santa Maria: UAB/NTE/UFSM.
Perry, R. J. (2017). Mechanisms by which a very-low-calorie diet reverses hyperglycemia in a rat model of type 2 diabetes. Cell Metabolism, 27(1), 1-8.
Pfaffl, M. W. (2010). The ongoing evolution of qPCR. Methods, 50(1), 215-216.
Rahman, T. U., et al. (2017). Hypertriglyceridemia in female rats during pregnancy induces obesity in male offspring via altering hypothalamic leptin signaling. Oncotarget, 8(32), 53450-53464.
Rajkumar, A. P. (2015). Experimental validation of methods for differential gene expression, analysis and sample pooling in RNA-seq. BMC Genomics, 16(1), 1-8.
Sambrook, J. F., Russel, D. W. (2001). Extraction, purification, and analysis of mRNA from Eukaryotic cells. In: Sambrook, J. F.; Russel, D. W. Molecular Cloning. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1, 7.4-7.9.
Shuckla, S. K., et al. (2017). HMGCS2 is a key to ketogenic enzyme potentially involved in type 1 diabetes with high cardiovascular risk. Nature Scientific Reports, 7(1), 1-10.
Si, X., et al. (2017). A comparison of RS4-type resistant starch to RS2-type resistant starch in supressing oxidative stress in high-fat-diet-induced obese rats. The Royal Society of Chemistry, 8(1), 232-240.
Silva, V. O., et al. (2015). β-glucans (Saccharomyces cereviseae) reduce glucose levels and attenuate alveolar bone loss in diabetic rats with periodontal disease. Plos One, 10(8), 1-13.
Silver, N., et al. (2006). Selection of housekeeping genes for gene expression studies in human reticulocytes using real-time PCR. BMC Molecular Biology, 7(33), 1-9.
Svingen, T., et al. (2015). Selection of reference genes for quantitative RT-PCR (RT-qPCR) analysis of rat tissue under physiological and toxicological conditions. PeerJ, 3(1), 1-15.
Tan, S. C. (2012). Identification of valid housekeeping genes for quantitative RT-PCR analysis of cardiosphere-derives cells preconditioned under hypoxia or with prolyl-4-hydroxylase inhibitors. Molecular Biology Reports, 39(1), 4857-4867.
Vandesompele, J., et al. (2002). Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biology, 3(1), 1-11.
Veres-Székely, A., et al. (2017) Selective measurement of a smooth muscle actin: why β-actin cannot be used as a housekeeping gene when tissue fibrosis occurs. BMC Molecular Biology, 18(1), 1-15.
Wang, H., et al. (2016). Diastolic dysfunction after estrogen loss in linked to cardiac chymase in WKY but not SHR rats. Hypertension, 68(1), 285-291.
Zhou, X., et al. (2017). An integrin antagonista (MK-0429) decreases proteinuria and renal fibrosis in the ZSF1 rat diabetic nephropathy model. Pharmacology Research and Perspective, 5(5), 1-14.
Zhu, X., et al. (2014). Selection and evaluation of reference genes for expression analysis using RT-qPCR in the beet armyworm Spodoptera exigua (Hübner) (Lepidoptera: Noctuidae). Plos One, 9(1), 1-9.
Descargas
Publicado
Cómo citar
Número
Sección
Licencia
Derechos de autor 2020 Marina Martins de Oliveira; Kalynka Gabriella do Livramento; Maísa Lamounier Magalhães; Luciano Vilela Paiva; Ana Paula Peconick
Esta obra está bajo una licencia internacional Creative Commons Atribución 4.0.
Los autores que publican en esta revista concuerdan con los siguientes términos:
1) Los autores mantienen los derechos de autor y conceden a la revista el derecho de primera publicación, con el trabajo simultáneamente licenciado bajo la Licencia Creative Commons Attribution que permite el compartir el trabajo con reconocimiento de la autoría y publicación inicial en esta revista.
2) Los autores tienen autorización para asumir contratos adicionales por separado, para distribución no exclusiva de la versión del trabajo publicada en esta revista (por ejemplo, publicar en repositorio institucional o como capítulo de libro), con reconocimiento de autoría y publicación inicial en esta revista.
3) Los autores tienen permiso y son estimulados a publicar y distribuir su trabajo en línea (por ejemplo, en repositorios institucionales o en su página personal) a cualquier punto antes o durante el proceso editorial, ya que esto puede generar cambios productivos, así como aumentar el impacto y la cita del trabajo publicado.
