Comparação de dois métodos de purificação de DNA de baixo custo para a detecção molecular de Salmonella em isolados de propés de aviários
DOI:
https://doi.org/10.33448/rsd-v12i1.39618Palavras-chave:
PCR em tempo real; Sílica; Chelex-100; Salmonella.Resumo
Existem muitos métodos de extração para purificar DNA bacteriano. A eficiência da PCR pode variar dependendo da quantidade e qualidade do DNA alvo utilizado. Este estudo avaliou a eficiência, qualidade, custo e rapidez de dois protocolos, sílica e Chelex-100, para a extração de vinte isolados de Salmonella oriundos de propés. O objetivo do experimento foi comparar os métodos de extração para detecção de espécies de Salmonella. O DNA foi extraído e submetido à PCR em tempo-real. Determinou-se a quantidade e integridade do DNA por espectrofotometria e eletroforese em gel de agarose e eficiência por qPCR. Para calcular o limite de detecção (LOD) uma cepa de referência S. Typhimurium foi diluída em série resultando nos coeficientes de regressão linear de R 2=0,992 (eficiencia 119,31) e R 2=0,958 (eficiencia 93,33) para sílica e Chelex, com LOD de 10 -4 para ambos. A Sílica rendeu mais DNA, 85,01 ± 59,11 comparado a 50,74 ± 12,95 e a razão 260/280 foi 1,77 ± 0,02 versus 1,63 ± 0,13. A sílica apresentou melhor integridade, gel com banda superior a 2.000 pb, enquanto o DNA do Chelex-100 pareceu imperceptível ou degradado. Com relação à PCR, a média do ciclo de quantificação (Cq) para sílica foi: 17,08 ± 0,73 e Chelex-100: 17,64 ±0,56 (sugerindo menor concentração de DNA). Os resultados mostraram que os métodos foram efetivos para a extração de Salmonella, uma vez que a PCR resultou positiva para todas as amostras, com eficiência superior para a sílica. O método Chelex-100 foi mais rápido e econômico.
Referências
Baratto, C. M., Gelinski, J. M. L. N., Bernardi, A. Z., Marafon, A., & Braun, F. (2012). Potential use of molecular-typing methods for the identification and characterization of Salmonella enterica serotypes isolated in the poultry production chain. Brazilian Journal of Poultry Science, 14, 173-179.
Boom, R., Sol, C. J., Salimans, M. M., Jansen, C. L., Wertheim-van Dillen, P. M., & van der Noordaa, J. (1990). Rapid and simple method for purification of nucleic acids. Journal of clinical microbiology, 28(3), 495-503.
Booth, C. S., Pienaar, E., Termaat, J. R., Whitney, S. E., Louw, T. M., & Viljoen, H. J. (2010). Efficiency of the Polymerase Chain Reaction. Chemical Engineering Science, 65(17), 4996-5006.
Borah, P., Porwollik, S., Desai, P., Nayak, P., Borah, P. P., Cheng, P., & McClelland, M. (2017). A simplified multiplex PCR-based typing method for common Salmonella enterica serovars supported by online server-based detection system. The Indian Journal of Medical Research, 146(2), 272.
Brasil (1995). Ministério da Agricultura. Pecuária e Abastecimento. Portaria nº 126 de 03 de novembro de 1995. Normas de Credenciamento e Monitoramento de Laboratórios de Diagnóstico das Salmoneloses Aviárias (S. Enteritidis. S.
Gallinarum. S. Pullorum e S. Typhimurium). Diário Oficial da União. Brasília. Seção 1. p. 3. Recuperado: 22/09/2022. Secretaria de Agricultura e Abastecimento.
Coordenadoria de Defesa Agropecuária. https://www.defesa.agricultura.sp.gov.br/legislacoes/portaria-sda-126-de-03-11-1995.372.htm
Bugarel, M., Granier, S. A., Weill, F. X., Fach, P., & Brisabois, A. (2011). A multiplex real-time PCR assay targeting virulence and resistance genes in Salmonella enterica serotype Typhimurium. BMC microbiology, 11(1), 1-11.
Bustin, S. A., Benes, V., Garson, J. A., Hellemans, J., Huggett, J., Kubista, M., Mueller, R., Nolan, T., Pfaffl, M. W., Shipley, G. L., Vandesompele, J., & Wittwer, C. T. (2009). The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical chemistry, 55(4), 611-622.
de Lamballerie, X., Zandotti, C., Vignoli, C., Bollet, C., & de Micco, P. (1992). A one-step microbial DNA extraction method using "Chelex 100" suitable for gene amplification. Research in microbiology, 143(8), 785-790.
Gupta, N. (2019). DNA extraction and polymerase chain reaction. Journal of cytology, 36(2).
Haddad, N., Ostyn, A., Karoui, C., Masselot, M., Thorel, M. F., Hughes, S. L., Inwald, J., Hewinson, R. G., & Durand, B. (2001). Spoligotype Diversity of Mycobacterium bovis Strains Isolated in France from 1979 to 2000. Journal of Clinical Microbiology, 39(10), 3623-3632.
Hashemi, A., & Baghbani‐Arani, F. (2015). The effective differentiation of Salmonella isolates using four PCR‐based typing methods. Journal of applied microbiology, 118(6), 1530-1540.
Hossain-Ripon, M. K., Hasan, M., Ahasan, M. M., Alam, M. W., & Kabir, S. (2011). Comparison of three different methods of genomic DNA extraction from gram positive and gram negative bacteria. Journal of Experimental Biosciences, 2(1), 55-60.
Issenhuth-Jeanjean, S., Roggentin, P., Mikoleit, M., Guibourdenche, M., de Pinna, E., Nair, S., Fields, P. I., & Weill, F. X. (2014). Supplement 2008-2010 (no. 48) to the White-Kauffmann-Le Minor scheme. Research in microbiology, 165(7), 526-530.
Karimnasab, N., Tadayon, K., Khaki, P., Moradi Bidhendi, S., Ghaderi, R., Sekhavati, M., & Asadi, F. (2013). An optimized method from Salmonella enterica Enteritidis for PCR experiments. Archives of Razi Institute, 68(2), 105-109.
Khan, A. S., Pierneef, R. E., Gonzalez-Escalona, N., Maguire, M., Li, C., Tyson, G. H., Ayers, S., Georges, K., Abebe, W., & Adesiyun, A. A. (2022). Molecular Characterization of Salmonella detected along the broiler production chain in Trinidad and Tobago. Microorganisms, 10(3), 570.
Kipper, D., Mascitti, A. K., De Carli, S., Carneiro, A. M., Streck, A. F., Fonseca, A. S. K., Ikuta, N. & Lunge, V. R. (2022). Emergence, Dissemination and Antimicrobial Resistance of the Main Poultry-Associated Salmonella Serovars in Brazil. Veterinary Sciences, 9(8), 405.
Lahiri, D. O., Bye, S., Nurnberger, J. I., Jr, Hodes, M. E., & Crisp, M. (1992). A non-organic and non-enzymatic extraction method gives higher yields of genomic DNA from whole-blood samples than do nine other methods tested. Journal of biochemical and biophysical methods, 25(4), 193-205.
Larionov, A., Krause, A., & Miller, W. (2005). A standard curve based method for relative real time PCR data processing. BMC Bioinformatics, 6(1), 62.
Lee, S. H., Jung, B. Y., Rayamahji, N., Lee, H. S., Jeon, W. J., Choi, K. S., Kweon, C. H. & Yoo, H. S. (2009). A multiplex real-time PCR for differential detection and quantification of Salmonella spp., Salmonella enterica serovar Typhimurium and Enteritidis in meats. Journal of Veterinary Science, 10(1), 43-51.
Liu, Y., Lee, M.-A., Ooi, E.-E., Mavis, Y., Tan, A.-L., & Quek, H.-H. (2003). Molecular Typing of Salmonella enterica Serovar Typhi Isolates from Various Countries in Asia by a Multiplex PCR Assay on Variable-Number Tandem Repeats. Journal of Clinical Microbiology, 41(9), 4388–4394.
Lucena-Aguilar, G., Sánchez-López, A. M., Barberán-Aceituno, C., Carrillo-Avila, J. A., López-Guerrero, J. A., & Aguilar-Quesada, R. (2016). DNA source selection for downstream applications based on DNA quality indicators analysis. Biopreservation and Biobanking, 14(4), 264-270.
Minitab 21.1.0 Statistical Software (2022). [Computer software]. State College, PA: Minitab Inc. (www.minitab.com)
Rubio, M. S., Penha, R. A. C., Almeida, A. M., Barbosa, F. O., & Berchieri, A. (2019). Duplex Real-Time PCR Using Sybr Green I for Quantification and Differential Diagnosis between Salmonella Enteritidis and Salmonella Typhimurium. Brazilian Journal of Poultry Science, 21(1), 1-6.
Salehi, T. Z., Madadgar, O., Tadjbakhsh, H., Mahzounieh, M. R., & Feizabadi, M. M. (2011). A molecular study of the Salmonella enterica serovars Abortusovis, Typhimurium, and Enteritidis. Turkish Journal of Veterinary & Animal Sciences, 35(5), 281-294.
Shivaprasad, H. L. (2000). Fowl typhoid and pullorum disease. Revue scientifique et technique (International Office of Epizootics), 19(2), 405-424.
Vingataramin, L., & Frost, E. H. (2015). A single protocol for extraction of gDNA from bacteria and yeast. BioTechniques, 58(3), 120-125.
Walker, N. J. (2002). A Technique Whose Time Has Come. Science, 296(5567), 557-59.
Wattiau, P., Boland, C., & Bertrand, S. (2011). Methodologies for Salmonella enterica subsp. enterica subtyping: gold standards and alternatives. Applied and environmental microbiology, 77(22), 7877-7885.
Wilson, I. G. (1997). Inhibition and facilitation of nucleic acid amplification. Applied and environmental microbiology, 63(10), 3741-3751.
Xiong, D., Song, L., Tao, J., Zheng, H., Zhou, Z., Geng, S., Pan, Z., & Jiao, X. (2017). An Efficient Multiplex PCR-Based Assay as a Novel Tool for Accurate Inter-Serovar Discrimination of Salmonella Enteritidis, S. Pullorum/Gallinarum and S. Dublin. Frontiers in microbiology, 8, 420.
Downloads
Publicado
Como Citar
Edição
Seção
Licença
Copyright (c) 2023 Julia Iracema Moura Pacheco; Ketlen Beatriz Alves dos Anjos; Isabela Vaz Silva; Rodrigo Gibrail Okar; Sonia Maria Biesdorf Dorneles Rodrigues; Aniê Ieda Francabandiera; Maria Constanza Rodriguez
Este trabalho está licenciado sob uma licença Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Autores que publicam nesta revista concordam com os seguintes termos:
1) Autores mantém os direitos autorais e concedem à revista o direito de primeira publicação, com o trabalho simultaneamente licenciado sob a Licença Creative Commons Attribution que permite o compartilhamento do trabalho com reconhecimento da autoria e publicação inicial nesta revista.
2) Autores têm autorização para assumir contratos adicionais separadamente, para distribuição não-exclusiva da versão do trabalho publicada nesta revista (ex.: publicar em repositório institucional ou como capítulo de livro), com reconhecimento de autoria e publicação inicial nesta revista.
3) Autores têm permissão e são estimulados a publicar e distribuir seu trabalho online (ex.: em repositórios institucionais ou na sua página pessoal) a qualquer ponto antes ou durante o processo editorial, já que isso pode gerar alterações produtivas, bem como aumentar o impacto e a citação do trabalho publicado.
