Métodos de extracción de DNA de espermatozoides caninos para sexado por PCR cuantitativa
DOI:
https://doi.org/10.33448/rsd-v12i4.40769Palabras clave:
Cromosoma; Perro; Fenol-cloroformo; Semen; Sexado de esperma.Resumen
Apesar de la similitud con otras células, el esperma tiene una cromatina compacta, lo que dificulta la extracción de DNA. En base a esto, este estudio comparó diferentes concentraciones de esperma y tres técnicas de extracción de DNA para su uso en la PCR cuantitativa (reacción en cadena de la polimerasa). Se probaron cuatro protocolos: no comercial usando fenol:cloroformo (M1) solo o asociado con un kit de preparación (Differex-System-Kit- M2) y dos protocolos comerciales con mini columnas de extracción-M3 (Illustra-Blood-Genomic-Prep-Mini-Spin) y M4 (Wizard®-Genomic-DNA-Purification). Se utilizaron cuatro concentraciones de esperma (1, 10, 30 y 50x106 células) del eyaculado de 3 perros. Después de la extracción, el DNA se utilizó para qPCR con primers dirigidos contra los cromosomas X e Y. Los protocolos M1 y M2 recuperaron una alta concentración de DNA independientemente de la concentración inicial de espermatozoides, con una relación satisfactoria en absorbancias de 260/280 (media 1,80 y 2,10, M1 y M2 respectivamente). Mientras que los otros métodos recuperaron baja concentración de DNA con baja calidad en M3 (media 1,60 en M3 y 1,85 en M4) independientemente de la concentración de espermatozoides. El DNA de espermatozoides caninos utilizando protocolos de fenol:cloroformo (M1 y M2) fue eficiente. El protocolo M1 permitió en particular la cuantificación de los cromosomas X e Y en qPCR utilizando un bajo número de espermatozoides (1x106). Según nuestro conocimiento, este estudio proporciona la primera comparación de las técnicas de extracción de DNA de esperma canino. Teniendo en cuenta los resultados obtenidos, se puede concluir que independientemente de la concentración de espermatozoides utilizada, la extracción de DNA de espermatozoides utilizando fenol:cloroformo tiene resultado satisfactorio de la muestra extraída y permite la cuantificación de la secuencia de genes diana en qPCR, lo que permitió su uso posterior en el sexado de espermatozoides y otras biotecnologías.
Citas
Abu-Amero, K. K., Jaeger, M., Plantinga, T., Netea, M. G., & Hassan, H. Y. (2013). Genetic variation of TLR2 and TRL4 among the Saudi Arabian population: insight into the evolutionary dynamics of the Arabian Peninsula. Genet. Test. Mol. Bioma, 17(2), 166-169.
Almeida, D. B., Santos, A. G., Costa, M. A. P., Oliveira, P. A., Bassini, L. N., Moreira, C. G. A., Carla, G. A., Tavares, R. A., & Moreira, H. L. M. (2009). Utilização de um novo protocolo de extração de DNA em tilápias (Oreochromisniloticus). In: XI Encontro de Pós-Graduação. Evoluir sem Extinguir: por uma ciência do devir. Pelotas: Editora e Gráfica Universitária.
Alvarez, M. J., Vila-Ortiz, G. J., Salibe, M. C., Podhajcer, O. L., Pitossi, F. J. (2007). Model based analysis of real-time PCR data from DNA binding dye protocols. BMC Bioinformatics, 8(85), 1-10.
Bueno, V. (2004). DNA e aperfeiçoamento das técnicas de extração. Rev. Bras. Hematol. Hemoter, 26(4), 233-234.
Coelho, E. G. A., Oliveira, D. A. A., Teixeira, C. S., Sampaio, I. B. M., Rodrigues, S. G., & Alves, C. (2004). Comparação entre métodos de estocagem de DNA extraído de amostras de sangue, sêmen e pelos e entre técnicas de extração. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec, 56(1), 111-115.
Crowe, J. S., Cooper, H. J., Smith, M. A., Sims, M. J., Parker, D., & Gewert, D. (1991). Improved cloning efficiency of polymerase chain reaction (PCR) product safter proteinase K digestion. Nucleic Acids Res, 19(1), 184-186.
Eddy, E. M. (2006). The spermatozoon. In EIL, J.D. Ed(s) Knobil and Neill’ Phisiology of Reproduction. United States of America: Elsevier, 3-54.
Edwards, K. T., Goddard, J., Jones, T. L., Paddock, C. D., & Varela-Stokes, A. S. (2011). Cattle and the natural history of rickettsia parkeri in Mississipi. Vec. Bor. Zoo. Dis, 11(5), 485-491.
Fernandes, J. V., Meissner, R. V., Fernandes, T. A. A. M., Rocha, L. R. M., Cabral, M. C., & Villa, L. L. (2004). Comparação de três protocolos de extração de DNA a partir de tecido fixado em formol e incluído em parafina. J. Bras. Patol. Med. Lab, 40(3), 141-146.
GE Manual. (2007). Illustra blood genomic Prep Mini Spin Kit. Available: https://au.vwr.com/assetsvc/asset/en_AU/id/17887080/contents
Hanson, E. K., & Ballantyne, J. (2004). A highly discriminating 21 locus Y-STR “megaplex” system designed to augment the minimal haplotype loci for forensic casework. J. Forensic Science, 49, 40-51.
Kamani, J., Baneth, G., Mumcuoglu, K. Y., Waziri, N. E., Eyal, O., Guthmann, Y., & Harrus, S. (2013). Molecular detection and characterization of tick-borne pathogens in dogs and ticks from Nigeria. PLOS Negl. Trop. Dis., 7(3), 1-7.
Kuretake, S., Kimura, Y., Hoshi, K., & Yanagimachi, R. (1996). Fertilization and development of mouse oocytes injected with isolated sperm heads. Biol Reprod, 55, 789-95.
Lalam, N. (2006). Estimation of the reaction efficiency in polymerase chain reaction. J. Theor. Biol, 242(4), 947–953.
Lee, K., Haugen, H. S., Clegg, C. H., & Braun, R. E. (1995). Premature translation of protamine 1mRNA causes precocious nuclear condensation and arrests spermatid differentiation in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 12451-55.
Lee, Y. K., Kim, H. W., Liu, C. L., Lee, H. K. A. (2003). A simple method for DNA extraction from marine bacterium that produce extracellular materials. J. Micro. Methods, 52, 245-250.
Liss, B. (2002). Improved quantitative real-time RT-PCR for expression profiling of individual cells. Nucleic Acids Res, 30(17), 1-9.
Marushige, Y., & Marushige, K. (1975). Transformation of sperm histone during formation and maturation of rat spermatozoa. J. Biol. Chem, 250, 39-45.
Mothé, G. B., Scott, C., & Souza, F. F. (2018a). Centrifugação em gradiente de densidade: alternativa para sexagem espermática em cães? Vet. e Zootec, 25, 9-19.
Mothé, G. B., Scott, C., Sicherle, C., Guaitolini, C. R. F., Freitas Dell’Aqua, C. P., Malossi, C. D., Araújo-Junior, J. P., & Souza, F. F. (2018b). Sperm sexing with density gradient centrifugation in dogs. Anim. Reprod. Sci., 199, 84-92.
Namba, H., Nakashima, M., Hayashi, T., Hayashida, N., Maeda, S., Rogounovitch, T. I., Ohtsuru, A., Saenko, V. A., Kanematsu, T., & Yamashita, S. (2003). Clinical implication of hot spot BRAF mutation, V599E, in papillary thyroid cancers. J. Clin. Endocrinol. Metab., 88, 4393–4397.
Oliveira, M. C. S., Regitano, L. C. A., Roese, A. D., Anthonisen, D. G., Patrocínio, E., Parma, M. M., Scagliusi, S. M. M., Timóteo, W. H. B., & Jardim, S. N. (2007). Fundamentos teórico-práticos e protocolos de extração e de amplificação de DNA por meio de reação em cadeia de polimerase. Embrapa Pecuária Sudeste. 12-17.
Pereira, A. S., Shitsuka, D. M., Parreira, F. J., & Shitsuka, R. (2018). Metodologia da pesquisa científica. UFSM.
Pógany, G. C., Corzett, M., Weston, S., Balhorn, R. (1981). DNA and protein content of mouse sperm. Implications regarding sperm chromatin structure. Exp. Cell Res, 136(1), 127-136.
Scott, C., Lourenço, T. T., Moira, D. S., Moscardini, M. M., Honsho, C. S., Souza, F. F. (2016). Viabilidade de espermatozoides criopreservados de touros colhidos do epidídimo após 12 horas a 4ºC. Rev. Bras. Ci. Vet., 23, 191-195.
Scott, C., Souza, F. F, Mothé, G. B., Aristizabal, V. H. V., & Dell’Aqua Junior, J. A. (2018). Estudo sobre as diferentes técnicas de sexagem de espermatozoides. Vet. e Zootec, 25, 9-17.
Seager, S. W. J., & Platz, C. C. (1977). Artificial insemination and frozen semen in the dog. Vet. Clin. North Am, 7, 757-64.
Silva, E. C. B., Pelinca, M. A., Acosta, A. C., Silva, D. M. F., Gomes Filho, M. A., & Guerra, M. M. P. (2014). Comparative study of DNA extraction methodologies from goat sperm and its effects on polymerase chain reaction analysis. Genet. Mol. Res, 13(3), 6070-78.
Svec, D., Tichopad, A., Novosadova, V., Pfaffl, M. W., & Kubista, M. (2015). How good is a PCR efficiency estimate: Recommendations for precise and robust qPCR efficiency assessments? Biomol. Detect. Quantif, 3, 9-16.
Taylor, T. M. (2005). Comparing calf sex ratio and semen sex ratio determined by conventional PCR. Dissertation of Master, Louisiana State University and Agricultural and Mechanical College, Program in Animal and Dairy Sciences, Southern Arkansas University, 10-11.
Tsukada, K., Asamura, H., Ota, M., Kobayashi, K., & Fukushima, H. (2006). Sperm DNA extraction from mixed stains using Differex System. Elsevier, International Congress Series, 1288, 700-703.
Wittwer, C. T., Herrmann, M. G., Moss, A. A., & Rasmussen, R. P. (1997). Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification. Biotechniques, 22(1), 130-138.
Descargas
Publicado
Cómo citar
Número
Sección
Licencia
Derechos de autor 2023 Gabriele Barros Mothé; Caroline Scott; Camila Dantas Malossi; João Pessoa Araújo-Junior; Fabiana Ferreira de Souza
Esta obra está bajo una licencia internacional Creative Commons Atribución 4.0.
Los autores que publican en esta revista concuerdan con los siguientes términos:
1) Los autores mantienen los derechos de autor y conceden a la revista el derecho de primera publicación, con el trabajo simultáneamente licenciado bajo la Licencia Creative Commons Attribution que permite el compartir el trabajo con reconocimiento de la autoría y publicación inicial en esta revista.
2) Los autores tienen autorización para asumir contratos adicionales por separado, para distribución no exclusiva de la versión del trabajo publicada en esta revista (por ejemplo, publicar en repositorio institucional o como capítulo de libro), con reconocimiento de autoría y publicación inicial en esta revista.
3) Los autores tienen permiso y son estimulados a publicar y distribuir su trabajo en línea (por ejemplo, en repositorios institucionales o en su página personal) a cualquier punto antes o durante el proceso editorial, ya que esto puede generar cambios productivos, así como aumentar el impacto y la cita del trabajo publicado.
