Métodos de extração de DNA de espermatozóides caninos para sexagem por PCR quantitativo
DOI:
https://doi.org/10.33448/rsd-v12i4.40769Palavras-chave:
Cromossomo; Cão; Fenol-clorofórmio; Sêmen; Sexagem espermática.Resumo
Apesar da semelhança com outros células, o espermatozoide possui cromatina compacta, dificultando a extração do DNA. Com base nisso, este estudo comparou diferentes concentrações espermáticas e três técnicas de extração de DNA para uso em PCRquantitativo. Quatro protocolos foram testados: um não-comercial utilizando fenol:clorofórmio (M1) sozinho ou associado a um kit preparatório (Differex-System-Kit-M2), e dois comerciais com mini colunas de extração – M3 (Illustra-Blood-Genomic-Prep-Mini-Spin) e M4 (Wizard®-Genomic-DNA-Purification). Quatro concentrações espermáticas foram utilizadas (1, 10, 30 and 50x106 células) do ejaculado de 3 cães. Após a extração, o DNA foi utilizado para qPCR com primers direcionados contra os cromossomos X e Y. Os protocolos M1 e M2 recuperaram alta concentração de DNA independente da concentração espermática inicial, com proporção satisfatória em absorbâncias de 260/280 (média 1,80 e 2,10, M1 e M2 respectivamente). Em contrapartida, os outros métodos recuperaram baixa concentração de DNA com baixa qualidade em M3 (média 1,60 em M3 e 1,85 em M4) independente da concentração espermática. A extração do DNA de células espermáticas caninas utilizando protocolos com fenol:clorofórmio (M1 e M2) foi eficiente. O protocolo M1 notavelmente permitiu a quantificação dos cromossomos X e Y no qPCR utilizando baixo número de células espermáticas (1x106). Este estudo fornece a primeira comparação de técnicas de extração de DNA de espermatozoide canino. Pode-se concluir que independente da concentração de espermatozoides utilizada, a extração do DNA de espermatozoides utilizando fenol:clorofórmio é satisfatória e possibilita a quantificação da sequência de genes alvo em qPCR, permitindo subsequente utilização na sexagem espermática e em outras biotecnologias.
Referências
Abu-Amero, K. K., Jaeger, M., Plantinga, T., Netea, M. G., & Hassan, H. Y. (2013). Genetic variation of TLR2 and TRL4 among the Saudi Arabian population: insight into the evolutionary dynamics of the Arabian Peninsula. Genet. Test. Mol. Bioma, 17(2), 166-169.
Almeida, D. B., Santos, A. G., Costa, M. A. P., Oliveira, P. A., Bassini, L. N., Moreira, C. G. A., Carla, G. A., Tavares, R. A., & Moreira, H. L. M. (2009). Utilização de um novo protocolo de extração de DNA em tilápias (Oreochromisniloticus). In: XI Encontro de Pós-Graduação. Evoluir sem Extinguir: por uma ciência do devir. Pelotas: Editora e Gráfica Universitária.
Alvarez, M. J., Vila-Ortiz, G. J., Salibe, M. C., Podhajcer, O. L., Pitossi, F. J. (2007). Model based analysis of real-time PCR data from DNA binding dye protocols. BMC Bioinformatics, 8(85), 1-10.
Bueno, V. (2004). DNA e aperfeiçoamento das técnicas de extração. Rev. Bras. Hematol. Hemoter, 26(4), 233-234.
Coelho, E. G. A., Oliveira, D. A. A., Teixeira, C. S., Sampaio, I. B. M., Rodrigues, S. G., & Alves, C. (2004). Comparação entre métodos de estocagem de DNA extraído de amostras de sangue, sêmen e pelos e entre técnicas de extração. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec, 56(1), 111-115.
Crowe, J. S., Cooper, H. J., Smith, M. A., Sims, M. J., Parker, D., & Gewert, D. (1991). Improved cloning efficiency of polymerase chain reaction (PCR) product safter proteinase K digestion. Nucleic Acids Res, 19(1), 184-186.
Eddy, E. M. (2006). The spermatozoon. In EIL, J.D. Ed(s) Knobil and Neill’ Phisiology of Reproduction. United States of America: Elsevier, 3-54.
Edwards, K. T., Goddard, J., Jones, T. L., Paddock, C. D., & Varela-Stokes, A. S. (2011). Cattle and the natural history of rickettsia parkeri in Mississipi. Vec. Bor. Zoo. Dis, 11(5), 485-491.
Fernandes, J. V., Meissner, R. V., Fernandes, T. A. A. M., Rocha, L. R. M., Cabral, M. C., & Villa, L. L. (2004). Comparação de três protocolos de extração de DNA a partir de tecido fixado em formol e incluído em parafina. J. Bras. Patol. Med. Lab, 40(3), 141-146.
GE Manual. (2007). Illustra blood genomic Prep Mini Spin Kit. Available: https://au.vwr.com/assetsvc/asset/en_AU/id/17887080/contents
Hanson, E. K., & Ballantyne, J. (2004). A highly discriminating 21 locus Y-STR “megaplex” system designed to augment the minimal haplotype loci for forensic casework. J. Forensic Science, 49, 40-51.
Kamani, J., Baneth, G., Mumcuoglu, K. Y., Waziri, N. E., Eyal, O., Guthmann, Y., & Harrus, S. (2013). Molecular detection and characterization of tick-borne pathogens in dogs and ticks from Nigeria. PLOS Negl. Trop. Dis., 7(3), 1-7.
Kuretake, S., Kimura, Y., Hoshi, K., & Yanagimachi, R. (1996). Fertilization and development of mouse oocytes injected with isolated sperm heads. Biol Reprod, 55, 789-95.
Lalam, N. (2006). Estimation of the reaction efficiency in polymerase chain reaction. J. Theor. Biol, 242(4), 947–953.
Lee, K., Haugen, H. S., Clegg, C. H., & Braun, R. E. (1995). Premature translation of protamine 1mRNA causes precocious nuclear condensation and arrests spermatid differentiation in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 12451-55.
Lee, Y. K., Kim, H. W., Liu, C. L., Lee, H. K. A. (2003). A simple method for DNA extraction from marine bacterium that produce extracellular materials. J. Micro. Methods, 52, 245-250.
Liss, B. (2002). Improved quantitative real-time RT-PCR for expression profiling of individual cells. Nucleic Acids Res, 30(17), 1-9.
Marushige, Y., & Marushige, K. (1975). Transformation of sperm histone during formation and maturation of rat spermatozoa. J. Biol. Chem, 250, 39-45.
Mothé, G. B., Scott, C., & Souza, F. F. (2018a). Centrifugação em gradiente de densidade: alternativa para sexagem espermática em cães? Vet. e Zootec, 25, 9-19.
Mothé, G. B., Scott, C., Sicherle, C., Guaitolini, C. R. F., Freitas Dell’Aqua, C. P., Malossi, C. D., Araújo-Junior, J. P., & Souza, F. F. (2018b). Sperm sexing with density gradient centrifugation in dogs. Anim. Reprod. Sci., 199, 84-92.
Namba, H., Nakashima, M., Hayashi, T., Hayashida, N., Maeda, S., Rogounovitch, T. I., Ohtsuru, A., Saenko, V. A., Kanematsu, T., & Yamashita, S. (2003). Clinical implication of hot spot BRAF mutation, V599E, in papillary thyroid cancers. J. Clin. Endocrinol. Metab., 88, 4393–4397.
Oliveira, M. C. S., Regitano, L. C. A., Roese, A. D., Anthonisen, D. G., Patrocínio, E., Parma, M. M., Scagliusi, S. M. M., Timóteo, W. H. B., & Jardim, S. N. (2007). Fundamentos teórico-práticos e protocolos de extração e de amplificação de DNA por meio de reação em cadeia de polimerase. Embrapa Pecuária Sudeste. 12-17.
Pereira, A. S., Shitsuka, D. M., Parreira, F. J., & Shitsuka, R. (2018). Metodologia da pesquisa científica. UFSM.
Pógany, G. C., Corzett, M., Weston, S., Balhorn, R. (1981). DNA and protein content of mouse sperm. Implications regarding sperm chromatin structure. Exp. Cell Res, 136(1), 127-136.
Scott, C., Lourenço, T. T., Moira, D. S., Moscardini, M. M., Honsho, C. S., Souza, F. F. (2016). Viabilidade de espermatozoides criopreservados de touros colhidos do epidídimo após 12 horas a 4ºC. Rev. Bras. Ci. Vet., 23, 191-195.
Scott, C., Souza, F. F, Mothé, G. B., Aristizabal, V. H. V., & Dell’Aqua Junior, J. A. (2018). Estudo sobre as diferentes técnicas de sexagem de espermatozoides. Vet. e Zootec, 25, 9-17.
Seager, S. W. J., & Platz, C. C. (1977). Artificial insemination and frozen semen in the dog. Vet. Clin. North Am, 7, 757-64.
Silva, E. C. B., Pelinca, M. A., Acosta, A. C., Silva, D. M. F., Gomes Filho, M. A., & Guerra, M. M. P. (2014). Comparative study of DNA extraction methodologies from goat sperm and its effects on polymerase chain reaction analysis. Genet. Mol. Res, 13(3), 6070-78.
Svec, D., Tichopad, A., Novosadova, V., Pfaffl, M. W., & Kubista, M. (2015). How good is a PCR efficiency estimate: Recommendations for precise and robust qPCR efficiency assessments? Biomol. Detect. Quantif, 3, 9-16.
Taylor, T. M. (2005). Comparing calf sex ratio and semen sex ratio determined by conventional PCR. Dissertation of Master, Louisiana State University and Agricultural and Mechanical College, Program in Animal and Dairy Sciences, Southern Arkansas University, 10-11.
Tsukada, K., Asamura, H., Ota, M., Kobayashi, K., & Fukushima, H. (2006). Sperm DNA extraction from mixed stains using Differex System. Elsevier, International Congress Series, 1288, 700-703.
Wittwer, C. T., Herrmann, M. G., Moss, A. A., & Rasmussen, R. P. (1997). Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification. Biotechniques, 22(1), 130-138.
Downloads
Publicado
Como Citar
Edição
Seção
Licença
Copyright (c) 2023 Gabriele Barros Mothé; Caroline Scott; Camila Dantas Malossi; João Pessoa Araújo-Junior; Fabiana Ferreira de Souza
Este trabalho está licenciado sob uma licença Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Autores que publicam nesta revista concordam com os seguintes termos:
1) Autores mantém os direitos autorais e concedem à revista o direito de primeira publicação, com o trabalho simultaneamente licenciado sob a Licença Creative Commons Attribution que permite o compartilhamento do trabalho com reconhecimento da autoria e publicação inicial nesta revista.
2) Autores têm autorização para assumir contratos adicionais separadamente, para distribuição não-exclusiva da versão do trabalho publicada nesta revista (ex.: publicar em repositório institucional ou como capítulo de livro), com reconhecimento de autoria e publicação inicial nesta revista.
3) Autores têm permissão e são estimulados a publicar e distribuir seu trabalho online (ex.: em repositórios institucionais ou na sua página pessoal) a qualquer ponto antes ou durante o processo editorial, já que isso pode gerar alterações produtivas, bem como aumentar o impacto e a citação do trabalho publicado.
